干货 | 日本注射剂灭菌工艺选择思路简介

引言：我们在进行注射剂一致性评价研究中，往往会发现参比制剂采用了湿热灭菌工艺，但该湿热工艺条件有显然又达不到F0>8。特别是一些来源于日本的注射剂，甚至于大输液的产品，都采用的是F0<8的灭菌工艺，这是怎么回事呢？查阅日本厚生省发布的《通过最终灭菌方法生产无菌药物的准则》（下文简称日本的无菌指南），探究一下日本对于灭菌工艺选择的要求。

虽然没有像欧盟一样画出灭菌选择决策树，但是日本在对灭菌工艺选择上的逻辑仍是基本一致的。那就是首选121℃，15min的湿热灭菌条件，次选F0>8的灭菌条件，如果产品不能耐热，再选择其他F0<8的其他热处理工艺。与欧盟无菌指南不同的是，日本对于F0<8的湿热工序选择有更加详尽的描述。

在日本无菌指南的附录——灭菌条件设计法中，提出可以选择A/B/C/D四种方法中的任何一种，保证产品的无菌。

A、半周期法；B、过度杀灭法；C、生物指示剂和微生物负载结合法；D、绝对微生物负载法。

A：半周期法

不知道为什么叫这个名字，从做法来看似乎应该叫双周期法更合适。这种方法是在灭菌柜冷点的位置放置了初始细菌计数为10⁶ CFU的生物指示剂，其灭菌时间是所有生物指示剂死亡时间的两倍。在过度杀灭法中，灭菌时间为12min，而在半周期法中，灭菌时间为14min至16min。初始细菌计数为10⁶ CFU的生物指示剂的存活概率在7 min时为10％，在8 min时为1％，因此（7 min至8min）× 2=14min至16min。与过度杀灭法相比，半周期法的时间会更长。欧盟药典推荐的灭菌条件为121℃，15min，其实按日本的话说就是半周期法。欧盟无菌指南提到采用121℃，15min的灭菌条件的产品申报时可以不提交灭菌验证资料，理由应该就是半周期法对无菌保证有着极高的保险系数。

B：过度杀灭法

就是大家耳熟能详的F0>12的灭菌条件，不再赘述。

C：生物指示剂和微生物负载结合法

简而言之，这种方法适合于不能终端灭菌，但还是能够耐受相对较高的F0值的产品。每批产品生产时，对灭菌前产品的耐热菌种进行鉴定，并在灭菌操作时加入预设的生物指示剂。生物指示剂的D值应高于每批产品经鉴定的耐热菌的D值。

这种方法基于生物指示剂的D值高于从菌种鉴定试验中获得的耐热细菌的D值的前提，并且灭菌时间通常根据以下公式设置：

灭菌时间 = D × log No / N

   D：生物指示剂的D121值

   No：微生物允许残存的概率（10^-6）

   N：细菌初始数量

这里的细菌初始数量是最大微生物负载加上标准偏差的3倍，即打出1 或2 个lg值的富余量。过度杀灭法的F0值能达到12以上，而生物指示剂和微生物负载结合法通常具有F0值在6至7。

例如，假设对某产品污染菌的情况进行了调查，细菌的初始数量（估计值）为10²cfu，通过筛选获得的最强耐热菌的D值为0.2分钟。那么，可以在实际灭菌工作中选择更高D值的生物指示剂（D121=0.5），要达到10^-6的杀灭目标则需要减少4 个lg值，则微生物F0值为F0 BIO = 4×D121 = 4×0.5 = 2.0。即该产品采用F0值=2的灭菌工艺即可达到实际微生物残存概率法<10^-6的效果。

此外，生物指示剂和微生物负载结合法，有必要进行每日微生物监控，并不断确认微生物负载的量和耐热菌的耐热性。

D：绝对微生物负载法

比起上述生物指示剂和微生物负载结合法，绝对微生物负载法适合于对热更加不稳定的品种。思路与前者类似，但不再使用D值更高的生物指示剂，而是直接使用产品中的最强耐热菌的D值来确定灭菌工艺的目标F0值

假设下图是某产品D值与温度之间的关系。

图 某产品D值与温度之间的关系图

从上图可以看出，耐热细菌的D121值为D121 = 10^{-0.1×121+11.5}= 0.25（分钟），耐热细菌为从10⁶减小到10^-6所需的F0值可以通过以下公式计算：

F0 = D121 ×（lgA－lgB）

将A =10⁶，B =10^-6，D121 = 0.25代入该式，得出F0 = 0.25×（6 + 6）= 3.0。

此处获得的F0 =3.0是设定灭菌条件的目标值，可依此选择灭菌条件并进行相应灭菌验证。实际上，在受控的生产设施中观察到的微生物负载实际上远少于10⁶cfu，例如，如果最大微生物负载被证明为10²cfu，则微生物杀灭数从10²减少到10^-6个。要求的最小F0值为0.25×（2 + 6）= 2.0，要求F0≥2.0即可确保无菌。

当然，在实际操作中，尚需考虑增加设定检测回收率等的安全系数，目标F0值不宜太低。

绝对微生物负载法，更加有必要进行连续并且频繁的微生物调查，如发现出现了更强的耐热菌，则需要评估对产品的影响。 

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总结：

综上，日本无菌指南最大的特点是对F0值<8的热处理工艺的选择进行了详细的讲解。这可能是日本的注射剂产品很多都采用这种终端热处理的原因所在。其实欧盟2019版的无菌指南对热处理的很多要求和日本是一致的。如其指出：“在灭菌工艺验证中的 SAL取决于用于工艺验证的生物指示剂的耐热性。当在灭菌工艺的验证中使用低D值的生物指示剂时，SAL在数值上更高，但是不提供与使用更耐热的生物指示剂一样高的安全阈值。SAL 应该始终与 D 值相关，D 值高于常规生产中的正常生物负载。”这里阐述的理念正如日本的生物指示剂和微生物负载结合法所表达的一样。灭菌条件可以降低，但必须基于科学的态度选择无菌保证水平最高的方式，并进行严格的验证和生产监控。 

令人遗憾的是，我国监管机构对灭菌工艺选择上有开倒车的趋势。《灭菌/无菌工艺验证指导原则》在2013年和2020年发布了两版征求意见稿，在2013年版是这样描述的：“目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F0≥12）和残存概率法（8≤F0<12）。用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，则应该按照无菌生产工艺要求。”而在2020版，是这样描述的：“注射剂的湿热灭菌工艺应首选过度杀灭法，即F0（标准灭菌时间）值大于12的灭菌工艺；对热不稳定的药物，可以选择残存概率法，即F0值大于8的灭菌工艺。如果F0值不能达到8，提示选择湿热灭菌工艺不合适，需要考虑无菌生产工艺。”原先的版本，虽然不向日本和欧盟一样对于F0值<8的热处理选择给出详细的指导，但也并没有禁止；新的版本则直接选择了一刀切。这样的做法，必然导致一部分注射剂的一致性评价做不下去（如输液产品原研F0值<8，而国内输液F0值>8是审评的红线），更可怕的是引导企业在一致性评价过程中逐渐降低注射剂的无菌保证水平（本可能采用的终端热处理都成了无菌灌装），长此以往临床应用的安全性问题将会逐渐显现。

希望我国的无菌指南在正式稿颁布时，能够学习发达国家的做法，更加科学，全面地指导企业研发和生产。